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磷酸化是細胞週期、細胞發育和分化的重要細胞訊息傳導過程中主要的調控子
蛋白質的磷酸化對於細胞是很重要的一種機制,在生物訊息傳遞路徑中,蛋白質的磷酸化與去磷酸化調控許多酵素和受體的活化與抑制。磷酸化通常發生在特定的氨基酸上,以Serine(絲胺酸)最多,再來是Threonine(蘇胺酸),最少的是Tyrosine(酪胺酸)。經過磷酸化之後的酪胺酸較容易利用抗體來純化,因此酪胺酸的磷酸化作用位置也較廣為了解。
目前使用的偵測磷酸化蛋白質的方式有其限制
磷酸化專一性抗體 最常被使用,但供不應求且成本高
32P同位素標記法 為放射性,難以取得
螢光磷酸化蛋白質染色法 只能做膠體染色且靈敏度差
質譜分析法 實驗流程長,昂貴且不普遍
pIMAGO 奈米聚合物是美國Tymora公司研發出來的獨特技術
一種新型的、非抗體、高效能、高選擇性的技術,pIMAGO奈米聚合物可結合到磷酸基團,不受氨基酸序列影響,無差別偵測磷酸化蛋白質。
pIMAGO奈米聚合物是水溶性的球狀樹枝狀聚合物,上面接有鈦(IV)離子,可高度特異性識別帶有負電的磷酸基團並與之結合。pIMAGO上另接有生物素或螢光報告基團,使信號放大,達到高靈敏度。pIMAGO奈米聚合物與磷酸化蛋白結合後,即可通過簡單的實驗方法 e.g., 化學發光法(chemiluminescence)、Western Blot、ELISA展開後續檢測工作。
優點
  • ◉ 無差別的偵測磷酸化蛋白質
  • ◉ 靈敏度高、特異性高
  • ◉ 良好的定量能力和線性度
  • ◉ 不需認特定氨基酸序列
  • ◉ 不需使用磷酸化蛋白抗體
  • ◉ 完整實驗套組、簡單快速的實驗流程,約3.5小時可完成實驗
應用
  • ◉ 體外激酶和磷酸酶測定法
  • ◉ 在免疫沈澱(IP)之後,檢測in vivo磷酸化蛋白
  • ◉ 激酶活性分析和激酶/磷酸酶抑製劑篩選
  • ◉ 多重檢測功能:可與總蛋白抗體一起偵測
pIMAGO提供三種偵測磷酸化蛋白的方式:
Membrane Detection - Western Blot 或 Dot Blot 偵測方式
Cat. No. Product Size
800-10/800-40 pIMAGO HRP Detection on
Western Blot (complete kit)
10 mini/40 mini blots
801-10/801-40 pIMAGO Fluor 550 Detection on
Western Blot (complete kit)
10 mini/40 mini blots
802-10/802-40 pIMAGO Fluor 680 Detection on
Western Blot (complete kit)
10 mini/40 mini blots
803-10/803-40 pIMAGO Fluor 800 Detection on
Western Blot (complete kit)
10 mini/40 mini blots
所有套組包括 *pIMAGO-biotin reagent, *streptavidin-based detection reagent, *blocking buffer, pIMAGO buffer, washing buffer 和 *control phosphoprotein. ECL substrate 並沒有包含在內。套組內有星號(*)的試劑可以另外單獨選購。
pIMAGO analysis of 6 protein mixture (2 phosphoproteins) avidin-HRP or avidin-Fluor detection.
 
Membrane Detection - Western Blot 或 Dot Blot 偵測方式
 
 
pIMAGO-based detection and quantification of phosphorylated b-casein signal compared to non-phosphoprotein BSA. Multiplexed detection of phspho-Cdb3 using pIMAGO in the 700 channel and anti-Cdb3 antibody in the 800 channel.
 
Cat. No. Product Size
900-100/900-400 pIMAGO HRP Colorimetric Detection
on Microplate (complete kit)
100 wells/
400 wells
901-100/901-400 pIMAGO Fluor 550 Detection on
Microplate (complete kit)
100 wells/
400 wells
902-100/902-400 pIMAGO Fluor 680 Detection on
Microplate (complete kit)
100 wells/
400 wells
903-100/903-400 pIMAGO Fluor 800 Detection on
Microplate (complete kit)
100 wells/
400 wells
所有套組包括*pIMAGO-biotin reagent, *streptavidin-based detection reagent, *blocking buffer, *binding buffer, pIMAGO buffer, *high-binding adsorption plates 和 *control phosphoproteins. HRP套組包含colorimetry substrate和stop solution.套組內有星號(*)的試劑可以另外單獨選購。
pIMAGO-based kinase assays of 5 kinases and their substrates, including control, ATP, and ATP + Kinase wells.
 
Microarray 偵測方式
目前正在開發pIMAGO系統的Microarray檢測 (Peptide/Protein Arrays, Kinase Substrate Arrays, Antibody Arrays) 若有興趣請與我們聯繫。
 
 
 
PolyMAC Phosphopeptide Enrichment(磷酸胜肽純化與富集)
美國Tymora公司亦有PolyMAC技術幫助純化磷酸胜肽與富集。
PolyMAC是接有鈦離子的奈米聚合物,在均質化含水份的環境中, PolyMAC的金屬離子可螯合磷酸胜肽,自胜肽混合樣品中純化出磷酸胜肽供質譜儀分析,進行蛋白質水解後胜肽的定性及定量。
100 µg of digested complex cell lysates from DG-75 B-cell lymphoma cells with different phosphorylation levels were used to compare the enrichment efficiency between titanium-based PolyMAC and other commercially available reagents. A number of unique phosphosites identified and percent enrichment selectivity were used as the parameters for comparison.
優點
  • ◉ 以PolyMAC純化的磷酸胜肽具有極高的重現性、選擇性、靈敏度與回收率
  • ◉ 萃取效果佳、實驗步驟簡便 (Binding→Wash→Elute),約一小時可完成萃取
 
兩種純化系統可選擇:
可選用磁珠或是瓊脂系統(Agarose gel beads)
Cat. No. Product Size
700-50/700-100 PolyMAC-Ti Magnetic
Phosphopeptide Enrichment Kit
(recommended)
50 enrichments/
100 enrichments
701-50/701-100 PolyMAC-Ti Agarose
Phosphopeptide Enrichment Kit
50 enrichments/
100 enrichments
所有套組包括 *PolyMAC-Ti reagent, *capture beads, loading buffer, washing buffer, capture buffer and elution buffer. 瓊脂系統(Agarose capture)套組包含可多次使用的*spin columns.磁珠套組不包含磁珠分離專用台架。套組內有星號(*)的試劑可以另外單獨選購。
 
 
 
 
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