儘管CRISPR-Cas9基因編輯技術已持續演進至可針對單一核苷酸進行編輯，然而，部份基因位點-特別是具有pyrimidine-rich protospacer-adjacent motif (PAM) 序列者，其基因位點不可及的特性，依然是Cas酵素充份發揮基因剪切能力的巨大阻礙。為了成功拓寬PAM序列的兼容性，無數科學家投注心力於篩選Cas蛋白變體(variants)；卻成效有限。直到隸屬於頂尖學術機構Broad Institute的David Liu實驗室透過定向演化蛋白工程，成功開發出可精準靶向人類基因組中大部份富含嘧啶PAM序列的四種全新Cas9變體。刊載於Nature Biotechnology的數據顯示出，研究團隊所開發出的全新Cas9變體，在數種不同的人類細胞皆展現出優於現有Cas9蛋白變體的活性。



成功拓寬PAM序列兼容性的明日之星-Nme2Cas9酵素

由研究團隊自腦膜炎雙球菌 (Neisseria meningitidis) 所篩選出的Nme2Cas9，已知針對富含嘧啶的N₄CC PAMs序列具有剪切活性，本身較小的分子量也使其較容易被傳遞至細胞內作為核酸酶和鹼基編輯器，Nme2Cas9同時也在哺乳動物細胞中表現出強大的活性。

 
整合三大全新技術成功實現Nme2Cas9定向演化

為了製造出全新的Nme2Cas9變體，研究團隊成功開發出一項全新的功能性篩選技術：SAC-PACE (sequence-agnostic Cas phage-assisted continuous evolution)。通過整合PAM結合、接續的鹼基編輯與 ΔgIII 噬菌體的繁殖，使得SAC-PACE分析法能夠識別以Cas9為基礎的基因編輯媒介與已產生改變的PAM兼容性。同時，研究團隊也開發出SAC-PACE與自動化培養平台eVOLVER的結合策略：ePACE，以提高實驗輸出量。接下來，團隊開發一種鹼基編輯依賴性的PAM分析法 (BE-PPA)，用於快速評估具PAM專一性的Cas9變體。分析方法涉及將具有鹼基編輯器的質體克隆到E. Coli 與包含目標鹼基與protospacer的質體文庫製備。在誘導鹼基編輯器表現後，成功收集可用於高通量測序的質體DNA。

 
定向演化後的Nme2Cas9變體在哺乳類細胞中展現比現有變體更優異的剪切活性

透過上述方法，研究團隊成功製造出四種可精準靶向PAM序列內單一核苷酸的Nme2Cas9 變體。其中，eNme2-C在所有N₄CC PAM位點成功將超過80%的A•T鹼基對轉換成G•C鹼基對，比現有變體Nme2-ABE8e高出4.8倍，展現出強大的鹼基編輯能力。為了確定此一優越的酵素活性是否能進一步於哺乳動物細胞中實現，研究團隊在進行定序前，將Cas effector質體與guide RNA轉染至數種人類細胞株，並透過使用HiScribe T7高產量RNA合成試劑盒，將脲苷 (uridine) 完全置換成TriLink的N1-methyl-pseudouridine。同時藉由TriLink獨家專利技術的CleanCap^® AG共轉染加帽試劑，將效應質體高效轉換成可用於體外轉錄的鹼基編輯器mRNA。與Nme2-ABE8e相比，eNme2-C在N₄CC PAM 位點上的編輯效率平均高出2.0倍，在N₄CD PAM位點 (其中D為A、G或T) 上的編輯效率則是高出15倍。

洞察先機，改變未來
由針對緊密型Cas9變體靶向單一核苷酸嘧啶PAM的持續演進高通量技術，有望輕鬆改善任何Cas直系同源物 (ortholog) 的功能活性。還可用於優化特定PAM或目標靶點的基因編輯，從而拓展CRISPR-Cas9基因編輯的疆界。


原始文章＞＞ Directed evolution of Cas9 broadens PAM sequence compatibility
 
Article reference: Huang TP, Heins ZJ, Miller SM, et al. High-throughput continuous evolution of compact Cas9 variants targeting single-nucleotide-pyrimidine PAMs. Nat Biotechnol. 2022; 10.1038/s41587-022-01410-2.
 
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